小鼠甲狀腺素（T4）定量檢測試劑盒（ELISA）操作方法

實(shí)驗(yàn)原理

本試劑盒采用競爭法酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）。在預(yù)包被抗小鼠甲狀腺素（T4）抗體（固相抗體）的微孔酶標(biāo)板中，加入小鼠甲狀腺素（T4）校準(zhǔn)品和待測樣本，再加入HRP標(biāo)記的小鼠甲狀腺素（T4）抗原（酶標(biāo)抗原），經(jīng)過溫育與充分洗滌，去除未結(jié)合的組分，在微孔板固相表面形成固相抗體-酶標(biāo)抗原的免疫復(fù)合物。加底物A和B，底物在HRP催化下，產(chǎn)生藍(lán)色產(chǎn)物，在終止液（2M 硫酸）作用下，最終轉(zhuǎn)化為黃色，在酶標(biāo)儀450nm波長上測定吸光度（OD值），吸光度（OD值）與待測樣品中小鼠甲狀腺素（T4）的濃度負(fù)相關(guān)。擬合校準(zhǔn)品曲線，可以計(jì)算出樣本中小鼠甲狀腺素（T4）的濃度。

試劑盒限制性

1、 僅供科研使用，不得用于臨床診斷。

2、 在試劑盒標(biāo)示的有效期內(nèi)使用，過期產(chǎn)品不得使用。

3、 跟其他廠家的試劑盒或者組分不能混用。

4、 使用試劑盒配套的樣品稀釋液。

5、 如果樣本值高于最高標(biāo)準(zhǔn)品濃度值，請(qǐng)將樣本適當(dāng)稀釋后，再重新測定。

6、 待測樣本中存在的人抗鼠等異嗜抗體會(huì)干擾檢測結(jié)果，檢測前，請(qǐng)排出該因素。

7、 通過其他方法得到的檢測結(jié)果，與本試劑盒測定結(jié)果不具有直接的可比性。

技術(shù)提示

1、 混合蛋白溶液時(shí)，避免起泡。

2、 加校準(zhǔn)品與樣本時(shí)，每個(gè)校準(zhǔn)品濃度和樣本都要更換移液槍頭，公共組分應(yīng)該懸臂加樣，避免交叉污染。

3、 合適的溫育時(shí)間，和充分的洗滌步驟，是保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確性的必要條件。

4、 使用自動(dòng)洗板機(jī)時(shí)，加入一個(gè)30秒浸泡的步驟，可以提高檢測精度。

5、 底物溶液為無色液體，保存過程中變?yōu)樗{(lán)色，代表底物溶液已經(jīng)失效，不得使用。

6、 終止液加樣順序與底物溶液加樣順序一致，加入終止液后，藍(lán)色底物產(chǎn)物，會(huì)瞬間變?yōu)辄S色。

7、 實(shí)驗(yàn)中，用剩的板條，應(yīng)立即放回自封袋中，密封（低溫干燥）保存。

8、 所有液體組分，使用前充分搖勻，嚴(yán)格按照說明書標(biāo)明的時(shí)間、加樣量及加樣順序進(jìn)行溫育操作。

試劑盒組分與保存

未開封的試劑盒保存在2-8度，不得使用過期試劑盒。

標(biāo)準(zhǔn)品濃度依次為：64、32、16、8、4、0 ng/mL.

其他用品

1、 酶標(biāo)儀（450nm）

2、 精密移液器及一次性吸頭

3、 蒸餾水

4、 洗瓶或者自動(dòng)洗板機(jī)

5、 37℃水浴鍋或恒溫箱

6、 500ml量筒

生物安全

1、 檢測必須符合實(shí)驗(yàn)室管理規(guī)范的規(guī)定，嚴(yán)格防止交叉污染，所有樣品、洗棄液和各種廢棄物都應(yīng)按照傳染物進(jìn)行處置。

2、 試劑盒的液體組分中，含有proclin-300防腐劑，可能引起皮膚過敏反應(yīng)，避免吸入煙霧與皮膚接觸。

3、 底物液對(duì)皮膚、眼睛和上呼吸道有刺激作用，避免吸入煙霧。

4、 戴上防護(hù)手套，實(shí)驗(yàn)完成后洗手。

樣品的采集和儲(chǔ)存

以下只是列出樣品采集和保存的一般指南。所有樣本采集保存過程中，不得使用疊氮鈉做為防腐劑。

1、 細(xì)胞培養(yǎng)上清：4000rpm條件下離心20min，去除細(xì)胞顆粒和聚合物，上清液保存在- 20℃以下，避免反復(fù)凍融。

2、 血清：使用不含熱原和內(nèi)毒素的試管，操作過程中避免任何細(xì)胞刺激，4000rpm條件下離心20min，小心地分離出血清，保存在-20℃以下，避免反復(fù)凍融。

3、 血漿：肝素，EDTA，或檸檬酸鈉作為抗凝劑。在4000rpm條件下，離心20分鐘取上清，血漿保存在-20℃以下，避免反復(fù)凍融。

樣本收集后，無法一次檢測完畢，請(qǐng)按一次用量分裝凍存，避免反復(fù)凍融，使用時(shí)在室溫下解凍，確保樣品均勻充分解凍。

4、 組織勻漿：用預(yù)冷的PBS (0.01 M,pH=7.4)沖洗組織，去除殘留血液，稱重后將組織剪碎。將剪碎的組織與對(duì)應(yīng)體積的PBS(一般按1: 9的重量體積比，比如1g的組織樣品對(duì)應(yīng)9 mL的PBS，具體體積可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要適當(dāng)調(diào)整，并做好記錄。推薦在PBS中加入蛋白酶抑制劑)加入玻璃勻漿器中，在冰上充分研磨。為了進(jìn)一步裂解組織細(xì)胞，可以對(duì)勻漿液進(jìn)行超聲破碎或反復(fù)凍融。最后將勻漿液5000×g離心 5-10分鐘，取上清檢測。

5、 細(xì)胞提取液：貼壁細(xì)胞用冷的PBS輕輕清洗，然后用胰蛋白酶消化，1000×g離心5分鐘后收集細(xì)胞；懸浮細(xì) 胞可直接離心收集。收集的細(xì)胞用冷的PBS洗滌3次。每 1×106 個(gè)細(xì)胞中加入150-200μLPBS重懸并通過反復(fù)凍融使細(xì)胞破碎(若含量很低可減少PBS的體積)。將提取液于1500×g離心10分鐘，取上清檢測。  

6、 其他生物體液：1000×g 離心20分鐘，除去雜質(zhì)及細(xì)胞碎片。取上清檢測。

試劑準(zhǔn)備

1、 使用前，所有的組分都要至少復(fù)溫60min，確保充分復(fù)溫到室溫。

2、 濃縮洗滌液：從冰箱取出的濃縮洗滌液，會(huì)有結(jié)晶產(chǎn)生，這屬于正?，F(xiàn)象，水浴加熱使結(jié)晶溶解。濃縮洗滌液與蒸餾水，按1:20稀釋，即1份的濃縮洗滌液，添加19份的蒸餾水。

3、 底物：底物液A和B，在使用前，按1:1體積充分混合，混合后15分鐘內(nèi)使用。

操作程序

所有試劑和組分都先恢復(fù)到室溫，標(biāo)準(zhǔn)品、質(zhì)控品和樣品，建議做復(fù)孔。

1、 按前面說明書描述的方法，配制好試劑盒各種組分的工作液。

2、 從鋁箔袋中取出所需板條，剩余的板條用自封袋密封放回冰箱。

設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔、空白孔和樣本孔，標(biāo)準(zhǔn)品孔各加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50μL，空白孔不加，樣本孔加待測樣本50μL。

3、除空白孔外，標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔，加入辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的檢測抗原100μL。

4、 用封板膜蓋住反應(yīng)板，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min。

5、 揭開封板膜，棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液，靜置20S，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復(fù)5次。若使用自動(dòng)洗板機(jī)，請(qǐng)按洗板機(jī)操作程序進(jìn)行洗板，添加浸泡30s的程序，可以提高檢測的精度。洗板結(jié)束，加底物前，要在干凈不掉屑的紙上，充分拍干反應(yīng)板。

6、 將底物A和B按1:1體積充分混合，所有孔中加入底物混合液100μL。用封板膜蓋住反應(yīng)板，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育15min。

7、 所有孔加入終止液50μL，在酶標(biāo)儀上讀取各孔吸光度（OD值）。

結(jié)果計(jì)算

1、 以標(biāo)準(zhǔn)品濃度做為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)的吸光度（OD值）作為縱坐標(biāo)，利用計(jì)算機(jī)軟件，采用四參數(shù)Logistic曲線擬合（4-pl），創(chuàng)建標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，通過樣本的吸光度（OD值），利用方程計(jì)算樣品的濃度值。

2、 如果樣品被稀釋，通過上述方法測的濃度值，要乘以稀釋倍數(shù)，才是樣品的最終濃度。

試劑盒性能指標(biāo)

1、物理性能

試劑盒的各液體組分應(yīng)澄清透明、無沉淀或者絮狀物。微孔板鋁箔袋應(yīng)真空包裝，無破損漏氣。

2、劑量反應(yīng)曲線線性

校準(zhǔn)品劑量反應(yīng)曲線相關(guān)系數(shù)r值，大于等于0.9900。

3、精密度

批內(nèi)精密度：三組已知的高、中、低濃度樣品，進(jìn)行二十次在同一個(gè)板塊內(nèi)精度評(píng)估。批內(nèi)變異系數(shù)CV%小于10%。

批間精密度：三組已知的高、中、低濃度樣品，進(jìn)行二十次在不同板塊內(nèi)精度評(píng)估。批間變異系數(shù)CV%小于15%。

4、靈敏度

小于0.1 ng/mL。

5、回收率

三組已知的高、中、低濃度樣品，進(jìn)行五次在同一個(gè)板塊內(nèi)回收率評(píng)估，回收率在85%-115%之間。

6、特異性

本試劑盒識(shí)別天然和重組小鼠甲狀腺素（T4），與結(jié)構(gòu)類似物無交叉。

7、穩(wěn)定性

2℃-8℃保存，有效期6個(gè)月。

8、 檢測范圍

2 ng/mL - 64 ng/mL